DNA-Extraktion aus Pflanzen

Zerkleinerte Zwiebeln und Extraktionspuffer im Eisbad

Grundlagen:

Mit dieser Methode kann man DNA aus pflanzlichen Gewebe isolieren. Das Gewebe wird mechanisch, die Zell- und Kernmembranen durch die Tensidwirkungen eines Spülmittels zerstört. Die Zellreste werden herausgefiltert, die Nukleinsäuren gelangen durch die groben Poren eines Kaffeefilters ins Filtrat.

Materialien:

In einmaliger Ausführung:

500 ml Standzylinder oder Becherglas, Spülmittel, Kochsalz, Trinatriumcitratdihydrat oder Trinatriumcitrat, große Plastikschalen für zentrale Eis- und Warmwasserbäder, Thermometer

In der Anzahl der Schülergruppen:

250-ml-Becherglas, Zwiebel, Küchenmesser, Küchenbrett, Wasserbad, Eisbad, Mörser und Pistill, Kaffeefilter und -trichter, Proteaselösung (Trypsin, Papain, enzymhaltiges Waschmittel, Ananassaft), eiskalter Spiritus (Tiefkühlfach eines normalen Kühlschranks), Farbstoff zum Anfärben der DNA: Azur B-Chlorid, Toluidinblau, Methylgrün, Schiffs-Reagenz, Methylenblau usw., Reagenzglasständer, Reagenzgläser, kleine Glasschale o.ä., Pipette

Ausgefällte DNA, ungefärbt

Durchführung:

1. Für alle Schülergruppen gemeinsam ansetzen:
   Extraktionspuffer in 500ml Standzylinder oder Becherglas ansetzen:
   • 13,2 g Trinatriumcitratdihydrat oder 11,5 g Trinatriumcitrat
   • 2,7 g Kochsalz
   • 30 ml Spülmittel
   • mit Wasser auf 300 ml auffüllen.
   Hinweis: Die DNA-Ausbeute kann erhöht werden, wenn eine Mischung aus Extraktionspuffer und Cellulase-Lösung (w = 2 %) im Volumenverhältnis 1 : 1 eingesetzt wird.
2. Eine Zwiebel (Kiwi, Banane, Tomate) hacken. Die Zwiebelstückchen in das 250ml Becherglas zu der Flüssigkeit von 30ml des Extraktionspuffers geben und gut durchmischen. Im Mörser fein zerreiben (mind. 5 Minuten lang).
3. Das Becherglas in ein Wasserbad mit 60 ^oC heißem Wasser stellen und dort 15 Minuten warm halten.
4. Das Becherglas in eine Schale mit Eis stellen. 3 Tropfen einer Protease-Lösung dazugeben. 5 Minuten lang kühlen.
5. Den Inhalt durch einen Kaffeefilter filtrieren (kein Laborfilter!).
6. Ein Reagenzglas ca. 2 cm hoch mit eiskaltem (!) Spiritus füllen. Mit einer Pipette vorsichtig langsam etwa ebenso viel Filtrat in den Spiritus tropfen. Die Flüssigkeit gut mischen. Die nun unlösliche DNA ist als weißlicher Klumpen sichtbar.
7. Zum Isolieren des Klumpens die überstehende Lösung fast ganz abgießen und die DNA mit dem letzten Tropfen in die kleine Glasschale spülen. Mit Wasser aus der Pipette spülen (Wasser dazugeben und wieder absaugen). Farbstofflösung zum Anfärben der DNA dazugeben, 5 Minuten einwirken lassen und dann wieder spülen. Der Nachweis ist positiv, wenn sich der Klumpen nach Zugabe von Wasser nicht mehr entfärben lässt. 

Ausgefällte DNA mit Methylenblau gefärbt

Erklärung