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(Isolierung und Restriktionskartierung von Plasmid-DNA)

Die Isolierung von rekombinanter Plasmid-DNA und deren Charakterisierung mit Hilfe von Restriktionsenzymen gehört zur täglichen Arbeit in einem molekularbiologischen Labor. Die Restriktionskartierung von DNA bildet zusammen mit der DNA-Sequenzierungstechnologie die Grundlage bei der Kartierung auch komplexer Genome. Mit Hilfe dieses Kits können Sie eine einfache Methode kennenlernen, mit der man Plasmid-DNA aus E.coli Zellen in analytischen Mengen isolieren und anschließend charakterisieren kann. Die Methode der Plasmid-Isolierung wird als "Minipräp" bezeichnet, da man aus einem kleinem Kulturvolumen nur analytische Mengen an Plasmid-DNA isoliert. Die isolierten DNA-Moleküle werden zunächst mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen in Fragmente definierter Länge gespalten. Die anschließende Auftrennung der entstandenen Fragmente in einem Agarosegel erlaubt es, eine sog. Restriktionskarte des Plasmids zu erstellen.
Das Plasmid, das Sie isolieren werden, trägt den Namen placZ. Es ist durch rekombinante DNA-Technologie entstanden, kommt also in dieser Form in der Natur nicht vor. Seine Funktionseinheiten sind jedoch natürlich vorkommenden Plasmiden entnommen. So z. B. der Replikationsursprung oder origin of replication (kurz ori), der dafür sorgt, daß das Plasmid unabhängig vom E. coli Chromosom repliziert werden kann und in einer Kopienzahl von circa 50 -100 in der Zelle vorliegt. Weiterhin trägt es ein Resistenzgen gegen Ampicillin (Ampr), das der Zelle eine Resistenz gegen dieses Antibiotikum verleiht. Ein permanenter Selektionsdruck, ausgeübt durch Ampicillin, verhindert Schwankungen der zellulären Plasmidkopienzahl oder gar den Verlust des Plasmids.
Der letzte Schritt der Konstruktion des Plasmids placZ ist in Abb. E2 dargestellt. Hierzu wurde ein sogenannter Klonierungsvektor, pMCS eingesetzt. Dieser enthält neben den bereits erwähnten Funktionselementen in einem bestimmten Abschnitt mehrere, unmittelbar benachbarte Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die sogenannte Multiple cloning site (kurz MCS). Über die Schnittstellen in der MCS kann fremde DNA mit passenden Schnittstellen (in unserem Fall das lacZ Gen aus E. coli), mit Hilfe des Enzyms DNA-Ligase in vitro mit dem Vektor verknüpft werden. Das resultierende Plasmid wurde als placZ bezeichnet. Zur stabilen Weitergabe des neu kombinierten, man sagt auch rekombinanten Plasmids wurde dieses durch Transformation in einen E. coli Stamm eingebracht. Zur Selektion der transformierten E. coli Zellen macht man sich das Ampicillin-Resistenzgen zu Nutze, denn auf einem Nährmedium mit Ampicillin können nur solche Bakterien Kolonien bilden, die das Plasmid aufgenommen haben.

Abb. E1 Klonierung des lacZ Gens mit Hilfe des Klonierungsvektors pMCS in schematischer Darstellung. Die einzelnen Schritte der Klonierung sind im Text erläutert.

In der Praxis muß man nachweisen, ob die Bakterien das rekombinante Plasmid aufgenommen haben und ob dieses auch tatsächlich das lacZ Gen trägt. Dies geschieht dadurch, daß man von einigen E. coli Kolonien Flüssigkulturen anlegt, aus diesen die Plasmide isoliert und mit den geeigneten Restriktionsenzymen (z. B. XhoI und PstI) schneidet. Die dabei entstehenden DNA-Fragmente werden gelelektrophoretisch analysiert. Aufgrund der Größe der erzeugten Fragmente können Rückschlüsse über die Struktur des Plasmids gezogen werden und eine Restriktionskarte erstellt werden. Diese gibt jedoch keine Auskünfte über die auf dem Plasmid lokalisierten Funktionselemente.